在定量PCR時，我們常常糾結一個問題，究竟是相對定量還是***定量呢？如今，你無需糾結了，因為數(shù)字PCR（digitalPCR）來了。盡管這兩種技術有些類似，都是估計起始樣品中的核酸量，但它們有一個重要的區(qū)別。定量PCR是依靠標準曲線或參照基因來測定核酸量，而數(shù)字PCR則讓你能夠直接數(shù)出DNA分子的個數(shù)，是對起始樣品的***定量。因此特別適用于依靠Ct值不能很好分辨的應用領域：拷貝數(shù)變異、突變檢測、基因相對表達研究（如等位基因不平衡表達）、二代測序結果驗證、miRNA表達分析、單細胞基因表達分析等。通過不同cluster的位置進行突變位點的判斷時存在誤判的現(xiàn)象。珠三角數(shù)字PCR熒光通道

Drop-off實驗包括兩個針對相同擴增子的TaqMan探針：與野生型序列互補而與突變位點不發(fā)生互補的Drop-off探針和與突變型和野生型基因都互補的Reference探針（如圖1A）。在野生型等位基因的存在下，Drop-off探針和Reference探針都將與目標雜交，產生雙重陽性信號（如圖1B，藍色群）。相反，如果存在突變的等位基因，即使一個核苷酸的突變也會阻止Drop-off探針與之雜交，因此只有Reference探針對目標基因進行退火，從而得到一個陽性信號。蘇州一體化數(shù)字PCR品牌dPCR可直接溯源SI國際單位制摩爾，適合單一、雙重及多重轉基因標準物質研究，一次可識別不同的轉基因區(qū)域。

基于數(shù)字PCR技術平臺，塔歌生物成功地開發(fā)了胎兒染色體非整倍體(T21,T18和T13)無創(chuàng)產前篩查試劑盒（數(shù)字PCR-NIPT），并已完成數(shù)百例臨床樣本驗證。數(shù)字PCR-NIPT的陽性檢出率和NGS相似，且成本接近血清學，可以在上述應急策略中取代血清學作為靈敏度和特異性更高的初篩方法，以有效提高陽性檢出率，降低需要復篩的假陽性樣本數(shù)和節(jié)省總的篩查成本。數(shù)字PCR應用前景廣闊，可用于病原微生物檢測、基因檢測、無創(chuàng)產前篩查、測序結果驗證等領域。但目前，大多數(shù)醫(yī)院采購的數(shù)字PCR儀器是用于科研層面，在臨床應用上仍處于起步階段，未得到普遍應用。

數(shù)字PCR平臺的評價指標有：分割單元數(shù)，熒光通道數(shù)，操作復雜性和污染風險。但是重要的是檢測準確性，評估數(shù)字PCR平臺的一種方法是使用多個數(shù)字PCR平臺互相驗證，另一種方法是使用定值準確的標準物質。目前的三代的PCR技術各有各的優(yōu)缺點，也各有各的應用領域，并不是一代取代一代的關系。技術的不斷進步給PCR技術注入了新的活力，使其能解鎖一個又一個的應用方向，使核酸檢測更方便、更準確。目前dPCR儀器的價格仍然十分昂貴，但隨著系統(tǒng)加工工藝的改進以及使用較便宜的材料，聚合成更小的體積[556]，其價格將會不斷的降低，使其應用到更多的檢測中。全自動數(shù)字PCR一體機可以適用于包括醫(yī)療檢測領域在內的多種應用場景。

在使用dPCR進行轉基因檢測時，通常直接參照qPCR的方法。使用不同技術對相同樣品檢測時，兩種方法的靈敏度是否具有可比性成為關注的問題。Burns等21]使用Fluidigm公司的12.765（12板，每板765個微單元）芯片數(shù)字PCR分析儀測定標準物質ERM-AD413檢測轉基因玉米MON810。該小組應用dPCR技術評估在qPCR定義下的靈敏度數(shù)值，在拷貝數(shù)200-700之間，dPCR與qPCR的測量結果具有一致性。但與qPCR的靈敏度相比，dPCR在低于拷貝數(shù)200時有被低估的風險，在高于拷貝數(shù)1000時有被高估的風險。dPCR在同一陣列上同時測量轉基因和內源性靶點時，需要稀釋內源性靶點和轉基因靶點在合理拷貝數(shù)范圍內以保證dPCR測量結果的準確性。通過創(chuàng)新技術微流控芯片，讓數(shù)字PCR單反應耗材價格進入個位數(shù)，實現(xiàn)了新的進步，也降低開發(fā)難度。臻準數(shù)字PCR

楊雁峰博士堅信數(shù)字PCR是可以應用于無創(chuàng)產前篩查的理想技術之一，這也是他2016年創(chuàng)立塔歌生物的初衷。珠三角數(shù)字PCR熒光通道

數(shù)字PCR實驗步驟包括：1）試劑配制：將10xdPCRBuffer、dPCR酶、引物和探針、無核酸酶水混合成dPCR預混液，并分裝到8聯(lián)排管中或96孔板中；將各待測樣本的核酸模板、陽性對照、陰性對照分別加入相應的8聯(lián)排管中或96孔板中；2）芯片進樣：在小海龜BioDigital·青全自動樣品處理系統(tǒng)上進行芯片上反應液進樣和液滴生成；3）芯片擴增：在小海龜BioDigital·青PCR擴增儀上進行芯片上PCR擴增反應；4）芯片閱讀：在小海龜BioDigital·青生物芯片閱讀儀上進行芯片上熒光信號閱讀；5）數(shù)據(jù)分析：使用生物芯片數(shù)據(jù)分析·青軟件進行數(shù)據(jù)分析和報告導出；珠三角數(shù)字PCR熒光通道

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