在定量PCR時，我們常常糾結(jié)一個問題，究竟是相對定量還是***定量呢？如今，你無需糾結(jié)了，因為數(shù)字PCR（digitalPCR）來了。盡管這兩種技術(shù)有些類似，都是估計起始樣品中的核酸量，但它們有一個重要的區(qū)別。定量PCR是依靠標(biāo)準曲線或參照基因來測定核酸量，而數(shù)字PCR則讓你能夠直接數(shù)出DNA分子的個數(shù)，是對起始樣品的***定量。因此特別適用于依靠Ct值不能很好分辨的應(yīng)用領(lǐng)域：拷貝數(shù)變異、突變檢測、基因相對表達研究（如等位基因不平衡表達）、二代測序結(jié)果驗證、miRNA表達分析、單細胞基因表達分析等。影響dPCR定量結(jié)果的因素：儀器采用的分散方式與數(shù)量、溶液稀釋方法、分散體積的準確性以及結(jié)果表達方式。法國醫(yī)療系統(tǒng)認證數(shù)字PCR技術(shù)

數(shù)字聚合酶鏈式反應(yīng)（digitalpolymerchainreaction，dPCR）技術(shù)因具有高靈敏度、受基質(zhì)干擾少等優(yōu)勢而被廣用于轉(zhuǎn)基因食品檢測。本研究綜述了數(shù)字PCR技術(shù)的原理、系統(tǒng)各部件的優(yōu)劣勢，梳理了數(shù)字PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)基因檢測與溯源技術(shù)（標(biāo)準物質(zhì)）方面的進展和發(fā)展趨勢，以期為轉(zhuǎn)基因食品檢測領(lǐng)域提供參考依據(jù)。dPCR的擴增過程大致上可以分為3步：樣品的分散、樣品的熱循環(huán)擴增和樣品的檢測。對于數(shù)字PCR儀器系統(tǒng)，各個部件之間仍然有較大的改進空間，要發(fā)揮部件之間的協(xié)同作用是很重要的，而且有持續(xù)研究的價值。表1中總結(jié)了部分常見的數(shù)字PCR系統(tǒng)的類型，以及相對在硬件、便攜性、性價比和自動化程度上的比較。廣東數(shù)字PCR儀器數(shù)字PCR是通過將一個樣本分成幾十到幾萬份，分配到不同的反應(yīng)單元，每個單元至少包含一個拷貝的目標(biāo)分子 。

dPCR在使用過程中需要特別注意體積誤差造成的結(jié)果偏差。體積誤差對于測量拷貝數(shù)濃度會產(chǎn)生偏差。目前dPCR中體積優(yōu)化方法以光學(xué)顯微鏡觀測為主。分散體積的差異會增加拷貝數(shù)結(jié)果的不確定性，Emslie等使用光學(xué)顯微鏡縱向拍照比較圖片邊緣的微小差異，考察了數(shù)字PCR系統(tǒng)中每個微孔內(nèi)和孔與孔間的體積差異對實驗結(jié)果的影響程度。Corbisier等使用微滴數(shù)字PCR對6種不同質(zhì)量分數(shù)棉籽粉質(zhì)粒DNA標(biāo)準物質(zhì)[ERM-AD623a-f，濃度范圍（10~10）copies/ul]進行分析，優(yōu)化了液滴體積得到相應(yīng)校正因子，并使用該校正因子發(fā)現(xiàn)并校準了運行軟件中液滴體積不變的假設(shè)而引起的數(shù)據(jù)偏離，數(shù)據(jù)結(jié)果的一致性有明顯提高。

目前dPCR主要有兩種形式，芯片式和液滴式，但基本原理都是將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片的微反應(yīng)器或微滴中，每個反應(yīng)器的核酸模板數(shù)少于或者等于1個。這樣經(jīng)過PCR循環(huán)之后，有一個核酸分子模板的反應(yīng)器就會給出熒光信號，沒有模板的反應(yīng)器就沒有熒光信號。根據(jù)相對比例和反應(yīng)器的體積，就可以推算出原始溶液的核酸濃度?？梢允褂脦追N不同的方法來分配樣品，包括微孔板，毛細管，油乳劑和帶有核酸結(jié)合表面的小型化腔室陣列。樣品的分配使人們可以通過假設(shè)分子種群遵循泊松分布來估計不同分子的數(shù)量，根據(jù)泊松分布的原理，反應(yīng)體系中目標(biāo)分子的拷貝數(shù)可以通過公式A=-ln[(N-X)/N]*N計算，從而解決了多個目標(biāo)分子存在于單個液滴中的可能性。dPCR在轉(zhuǎn)基因檢測方面的應(yīng)用仍處于研究和探索的階段。

由于現(xiàn)有的商業(yè)化數(shù)字PCR設(shè)備在物理上只設(shè)置了2個檢測通道，所以存在一個明顯的短板：不能同時進行多個位點的檢測。在樣品多位點的檢測中，就需要更多的起始樣品，但臨床上組織的樣品非常有限。相比之下熒光定量PCR儀上就很容易實現(xiàn)多重檢測。為了考察利用數(shù)字PCR實現(xiàn)多重檢測的可能性，英國TheInstituteofCancerResearch的研究人員以非小細胞肺相關(guān)的KRAS基因為檢測對象，在Bio-Rad的數(shù)字PCR系統(tǒng)上通過3個三重ddPCR檢測體系來實現(xiàn)9個KRAS突變位點的檢測。數(shù)字PCR作為研發(fā)階段的驗證方案之一。廣東數(shù)字PCR儀器

數(shù)字PCR技術(shù)min檢測下限可到2copies/ml，比qPCR靈敏度提升了100倍。法國醫(yī)療系統(tǒng)認證數(shù)字PCR技術(shù)

數(shù)字PCR的引物和探針設(shè)計規(guī)則同熒光定量PCR是類似的，具體規(guī)則如下：1、查找和選擇目標(biāo)序列設(shè)計引物和探針的第一步是得到感興趣基因的核酸序列。找到基因保守區(qū)域：基因的保守區(qū)域是指來自同一屬/種/亞型的、在某個基因上堿基序列差別很小或沒有差別的區(qū)域。根據(jù)需要，使用ClustalX或ClustalW等軟件對齊屬于同一屬/種/亞型的基因的一組序列，在對齊序列的保守區(qū)域設(shè)計引物，并確保引物結(jié)合位點處的保守序列與其它非待檢測的屬/種/亞型的堿基序列具有較大的差異。擴增產(chǎn)物長度（AmpliconLength）：可在75-200bp之間（產(chǎn)物長度=下游引物位置-上游引物位置+1）。法國醫(yī)療系統(tǒng)認證數(shù)字PCR技術(shù)

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