許多生物醫(yī)學(xué)成像方式，無論是單光子(共聚焦)或多光子(雙光子)，都使用激光作為光源，并需要兼容的熒光染料。熒光染料有自己的激發(fā)波長，它們可以被單個光子以該激發(fā)波長的光子能量激發(fā)(E=hv=h*c/λ);或者是兩個幾乎同時到達的光子，但每個光子的能量約為單光子能量的一半，即雙波長(0.5E->2λ)。前者是單光子顯微鏡原理，后者是雙光子顯微鏡原理。在對同一種熒光染料進行成像時，雙光子與單光子相比可以使用約兩倍波長，因此雙光子的散射較小(波長較長，散射較小)，可以更深入地滲透到組織中。雙光子顯微鏡不需要共聚焦細孔，提高了熒光檢測效率。進口熒光激光雙光子顯微鏡成像視野一般是多少

和很多偉大的科學(xué)發(fā)明一樣，雙光子顯微鏡的出現(xiàn)也有一點偶然，但正是那瞬間的靈感為生物科學(xué)尤其是神經(jīng)科學(xué)帶來了一種**性的成像技術(shù)：雙光子激發(fā)熒光顯微鏡。1990年初，當(dāng)WinfriedDenk剛從康奈爾大學(xué)博士畢業(yè)準備前往瑞士讀博后時，他看了一本關(guān)于激光掃描顯微鏡的書，從中了解到非線性光學(xué)效應(yīng)——強光和物質(zhì)的相互作用。當(dāng)時，Denk有同事研究生物樣品中的鈣離子但苦于沒有強大的紫外激光器和光學(xué)元件，于是他就想到如果使用雙光子吸收就能夠繞開紫外，換言之，與其通過一個紫外光子激發(fā)標記的鈣離子，通過兩個雙倍波長的可見光光子也能激發(fā)相同的熒光。有了想法后馬上實驗。借了一套染料飛秒激光器，Denk聯(lián)合他的導(dǎo)師WattWebb及其博士生JamesStrickler只用六個小時就完成了實驗搭建，采集數(shù)據(jù)則用了兩到三天，于是一篇里程碑式的文章就此誕生了。國內(nèi)bruker雙光子顯微鏡光損傷雙光子顯微鏡結(jié)合了雙光子激發(fā)技術(shù)和激光掃描共聚顯微鏡。

通過對顯微光學(xué)系統(tǒng)的重新設(shè)計，將FHIRM-TPM2.0的成像視場擴展至420×420平方微米，顯微物鏡的工作距離擴展至1mm，實現(xiàn)無創(chuàng)成像。嵌入可拆卸的快速軸向掃描模塊，實現(xiàn)深度180微米的三維體成像和多平面快速切換的實時成像。該模塊由一個快速電動變焦鏡頭和一對中繼鏡頭組成，在不同深度成像時保持放大率恒定。其中，變焦模塊重1.8克，科研人員可以根據(jù)實驗要求自由拆卸。此外，新型微型成像探頭可以瞬間插拔，極大簡化了實驗操作，避免了長時間實驗對動物的干擾。反復(fù)裝卸探針追蹤同批神經(jīng)元時，視場旋轉(zhuǎn)角度小于0.07弧度，邊界偏差小于35微米。

從雙光子的原理和特點我們就可以明顯的得出雙光子的優(yōu)點：☆光損傷?。河捎陔p光子顯微鏡使用的是可見光或近紅外光作為激發(fā)光源，這一波段的光對***細胞和組織的光損傷小，適用于長時間的研究；☆穿透能力強：相對于紫外光，可見光和近紅外光都具有更強的穿透能力，因而受生物組織散射的影響更小，解決對生物組織中深層物質(zhì)的層析成像研究問題；☆高分辨率：由于雙光子吸收截面很小，只有在焦平面很小的區(qū)域內(nèi)可以激發(fā)出熒光，雙光子吸收只局限于焦點處的體積約為波長3次方的范圍內(nèi)；☆漂白區(qū)域小：由于激發(fā)只存在于交點處，所以焦點以外的區(qū)域都不會發(fā)生光漂白現(xiàn)象；☆熒光收集率高：與共聚焦成像相比，雙光子成像不需要光學(xué)濾波器（共焦***），這樣就提高了對熒光的收集率，而收集率的提高直接導(dǎo)致圖像對比度的提高；☆圖像對比度高：由于熒光波長小于入射波長，因而瑞利散射產(chǎn)生的背景噪聲只有單光子激發(fā)時的1/16，較大降低了散射的干擾；☆光子躍遷具有很強的選擇激發(fā)性，所以可以對生物組織中一些特殊物質(zhì)進行成像研究；由于其非侵入性和高分辨率的特點，雙光子顯微鏡成為了研究神經(jīng)科學(xué)、ai癥研究、免疫學(xué)等領(lǐng)域的重要工具。

隨著技術(shù)的發(fā)展，雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優(yōu)化，結(jié)合它的特點，大致可以分成深和活兩個方面的提升。要想讓激發(fā)激光進入更深的層面，大致可從兩個方面入手，裝置優(yōu)化與標本改造。關(guān)于裝置優(yōu)化，我們可以把激光束變得更細，使能量更加集中，就能讓激光穿透更深。關(guān)于標本，其中影響光傳播的主要是物質(zhì)吸收和散射，解決這個問題，我們需要對樣本進行透明化處理。一種方法是運用某種物質(zhì)將標本浸泡，使其中的物質(zhì)（主要是脂質(zhì)）被破壞或溶解。另一種方法是運用電泳將脂質(zhì)電解，讓標本的“透明度”提高。雙光子顯微鏡還可以對一些具有雙光子特性的染料細胞進行特定實驗；進口激光雙光子顯微鏡成像視野是多少

雙光子顯微鏡知多少。進口熒光激光雙光子顯微鏡成像視野一般是多少

隨著技術(shù)的發(fā)展，雙光子顯微鏡的性能不斷優(yōu)化。結(jié)合其特點，大致可以分為兩個方面:深入和主動改進。為了使激發(fā)激光進入更深的層次，可以從器件優(yōu)化和標本改造兩個方面入手。關(guān)于器件的優(yōu)化，我們可以把激光束做得更細，集中能量，讓激光穿透得更深。對于樣品，物質(zhì)的吸收和散射是影響光傳播的主要因素。為了解決這個問題，我們需要將樣本透明化。一種方法是用某種物質(zhì)浸泡標本，使其中的物質(zhì)(主要是脂質(zhì))被破壞或溶解。另一種方法是通過電泳電解脂類，從而提高標本的“透明度”。進口熒光激光雙光子顯微鏡成像視野一般是多少